アネキシン V およびカスパーゼ 3 免疫染色で検出された、実験的くも膜下出血後の心室周囲臓器のアポトーシスと壊死
目的: 心室周囲臓器 (CVO) は、ほとんどの自律神経機能と内分泌機能に不可欠です。外傷や出血は機能に影響を与える可能性があります。この研究の目的は、アネキシン V 親和性とカスパーゼ 3 免疫染色を使用して、 ラットの実験的くも膜下出血(SAH)後のCVOにおけるアポトーシスと壊死を調査することでした。
方法: 3 つの実験グループを使用しました: SAH 後 1 日目と 2 日目、およびコントロール グループ、それぞれ 7 匹の Wistar アルビノ ラット。くも膜下出血は経斜脳底動脈穿刺によって行われた。ラットを心臓が停止するまで０．９％ＮａＣｌおよび０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４で灌流した。 CVO のアポトーシスと壊死は、アネキシン V 染色によるフローサイトメトリーとカスパーゼ 3 免疫染色によって測定されました。
結果: 終端血管層器官におけるアポトーシス(OVLT) 、 高さ中央値（ME）および後面積（AP）は、1日目グループの方が対照グループよりも有意に高かった。椎弓下臓器（SFO）、OVLT、MEおよびAPのアポトーシスは、2日目のグループで対照グループよりも有意に高かった。 AP を除いて、1 日目と 2 日目のグループの間には有意な差がありました。 SFOとOVLTの壊死は、1日目または対照群よりも2日目のグループで有意に高かったが、MEとAPの壊死は3つのグループ間で差がなかった。 。カスパーゼ 3 陽性細胞密度は、1 日目および対照群よりも 2 日目のグループでより強かった。
考察: アポトーシスの予防により、アポトーシス後の CVO 機能障害が改善される可能性がある。 SAH.
はじめに
アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、くも膜下出血(SAH)などの病理学的状態で変化します。 .1 アポトーシスは、初期の脳損傷 2、血管けいれん 3、および SAH 後に見られる脳梗塞 4 の発症に寄与する因子であると考えられています。文献では、SAH 後のアポトーシス 1,2,5,6 および壊死 7,8 が報告されており、アポトーシス阻害剤の投与によりこれらが改善されたことが研究で実証されています。 dSAH後のアポトーシス経路の阻害は、細胞死を減少させるだけでなく、機能的転帰にも大幅な改善をもたらし、2,4、したがって、アポトーシス経路に関連する二次的損傷の多くを抑制した可能性がある。 SAH.1
脳の多くの重要な中枢に加えて、脳弓下器官(SFO)などの多くの感覚室周囲器官 (CVO) 、 終端血管板器官 (OVLT)、後部領域 (AP)、 および正中隆起 (ME、分泌型 CVO) はSAH の影響を受けます。 /strong>strong>9,10 心室周囲臓器は神経伝達物質が豊富で、血液脳関門がありません。11,12
アネキシン V は、強く相互作用することが示されており、特にホスファチジルセリンを使用するため、初期アポトーシスの検出に使用できます。15 カスパーゼ 3 免疫染色は、組織サンプルのアポトーシスを検出するために現在使用されているもう 1 つの方法です。16
この研究では、初期アポトーシスと後期アポトーシスの存在を調査しました。ラットにおける実験的SAH後のCVOにおけるアネキシンV親和性およびカスパーゼ3免疫染色によるアポトーシス/壊死。私たちの文献レビューでは、この主題を扱った以前の報告は見つかりませんでした。
材料と方法
研究プロトコルは、Bu によって承認されました。 �レント・エジェビット大学動物倫理委員会。
実験は、トルコのゾングルダクにあるビュレント・エジェビット大学医学部の実験外科、研究および動物実験室で行われた。合計21匹の体重200～300gの雄成体Wistarアルビノラットが研究に含まれた。すべてのラットは、適切な湿度、22 ～ 25 ℃で、12/12 時間の明暗サイクルで飼育され、水分と食物を自由に与えられました。ラットを次の 3 つのグループに分けました: SAH 後 1 日目 (n 5 7)、SAH 後 2 日目(n 5 7)、 および対照(n 5 7)。 >
ラットは、 ケタミン (60 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内注射によって麻酔されました。実験的 SAH は、以前に説明した Barry ら 17 によって記載された技術と同様の技術を使用して実施されました。9,10
簡単に説明すると、手術下で仰臥位で頸部正中線切開を行いました。顕微鏡（Takagi OM-5、日本）を使用し、前咽頭アプローチを使用してクリバスを露出させました。骨ばった窓 橋前槽を開かないように細心の注意を払いながら、大口径の針を使用して脳底動脈の前に動脈を作成しました。外径75 mm の縫合針（Ethicon、リビングストン、英国）を脳底動脈に挿入しました。針を抜くと、くも膜下腔に広範囲の出血が発生し、嗅覚領域にまで均一に分布しました。ラットは、SAH後、適切な条件下で 1 日間および 2 日間生存させました。
ラットは灌流によって安楽死させました。麻酔下で開胸が行われ、次に左心室にカニューレが挿入され、下行大動脈がクランプされ、右心房が切開され、頭部および頸部領域から血液が0.9% NaCl および0.1M リン酸緩衝液 (pH 7.4) で洗浄されました。心臓が止まるまで。動物の首を切り落とし、ラット定位脳地図 (Paxinos & Watson) を使用して SFO、OVLT、ME、AP のサンプルを取得しました。
アネキシン V 法の原理. は、
アポトーシス中に細胞内膜から外尖に移動するホスファチジルセリンに対するアネキシン V の親和性をフローサイトメトリーで測定することです。15 細胞はさまざまなCVO
から採取されました。強い > を個別に指定します。各サンプルに 100 ml の細胞懸濁液を使用しました。フルオレセイン イソチオシアネートと結合したアネキシン V は、 ヨウ化プロピジウム(PI)の存在下でアポトーシス細胞を(FITC) で染色しました。この反応により、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリンの検出が可能になります。 PI 陽性細胞とアネキシン V 陽性細胞は両方とも、壊死状態の割合を示しました。メーカーの指示に従って、 市販のアネキシンFITC キット (Beckman-Coulter、米国カリフォルニア州フラートン) を使用し、CoulterFC500 を使用しました。 > > フローサイトメーター(Beckman-Coulter)。初期アポトーシス中の膜脂質非対称性の喪失およびホスファチジルセリンへのアネキシン V 特異的結合の概略図を図に示します。 1. PI 陽性およびアネキシン V 陽性細胞は、後期アポトーシスまたは壊死(図 1)を示します。組織病理学的および免疫組織化学的分析の場合は、CVOラットの脳から得られたものをすべてのグループに使用しました。各ラットの脳室周囲臓器サンプルを 10% 中性ホルマリン溶液で固定し、パラフィンワックスに包埋しました。切片はクライオスタット上で 5 ～ 6 mm に切断されました 厚さ次に組織切片を脱蝋し、 組織形態学的分析のためにヘマトキシリン・ エオシン(H&E)とクレシルバイオレットで染色しました。心室周囲臓器は、 研究グループに盲検化された単一の病理学者（FB） によって光学顕微鏡下で評価されました。アポトーシスを評価するために、 ポリクローナル抗体アンチカスパーゼ 3（CPP32） （Neomarks、カタログ番号RB-1197R7、米国カリフォルニア州フリーモント） を使用した免疫組織化学分析も実施されました。免疫染色は、ホルマリン固定パラフィンワックス包埋組織を使用したマイクロ波抗原回復を伴うストレプトアビジン ビオチン ペルオキシダーゼ複合体技術に基づいていました。ワックスに包埋された切片をスライド上に収集し、脱ワックスして再水和しました。脱蝋後、切片を濾過水中の10%水素ペルオキシダーゼで処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックしました。抗原を賦活化するために、スライドを 10 mmol/L クエン酸緩衝液(pH 7) で電子レンジで 10 分間煮沸しました。次に、 スライドを、 カスパーゼ 3 ウサギポリクローナル抗体（Neomarks、カタログ番号 RB1197-R7、米国カリフォルニア州フリーモント） を含む一次抗血清とともにインキュベートしました。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、スライド上の組織をビオチン結合二次抗体とインキュベートし、続いてストレプトアビジン ビオチン システム コンポーネント中で室温で 30 分間インキュベートしました。サンプルを 3,39-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB; Lab Vision、Fremont、CA、USA）に浸漬すると、反応が見えるようになりました。その後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、すすいでマウントしました。ネガティブコントロールでは一次抗体を省略し、扁桃腺組織をポジティブコントロールとして使用しました。カスパーゼ 3 の免疫反応性は主に細胞質で観察され、核染色も多少ありました。スライドは、1 人の病理医(FB)によって盲検法で評価されました。カスパーゼ 3 陽性細胞密度によって測定されるアポトーシスは、各グループの CVO で評価されました。
統計分析
社会科学のための統計パッケージすべてのデータ分析には（バージョン 19.0; SPSS Inc、米国イリノイ州シカゴ） が使用されました。結果は中央値と範囲として表されました。 Shapiro-Wilk 検定は正規分布を持たない変数の正規性検定に使用され、Kruskal-Wallis 検定は 3 つのグループ間の比較に使用されました。コノバーテストは、 事後の比較に使用されます。すべての統計的比較について、0.05 が統計的に考慮されました。
結果
フローサイトメトリーの結果を表 1 にまとめます。PI/アネキシンの有意 V から得られたグラフ。 SFO、OVLT、MEおよび AP(コントロールおよび 2 日目グループ)のフローサイトメトリー分析を図に示します。 2. 1 日目のグループでは、 中央値 (範囲) として示される初期アポトーシスの結果は次のとおりでした: OVLT 0.50% (0.08–1.89)、ME 0.55% (0.21–0.84)、および AP 0.46% (0.20–1.86)、SFO のアポトーシス対照群と有意な差はなかった。 2日目のグループの初期アポトーシスは次のとおりでした: SFO 1.88% (0.97-2.99)、OVLT 1.85% (0.77-3.16)、ME 0.79% (0.54-1.43)、AP 0.82% (0.19-1.49) ). )であり、4つの領域すべてにおいて対照群よりも有意に高かった。対照群では、早期アポトーシスはSFO で 0.12% (0.02 ～ 0.35)、OVLT で 0.15% (0.04 ～ 0.71)、0.18% (0.09 ～ 0.34)でした。 > > ME では、 AP では 0.06% (0.01 ～ 0.24)。
SFO の壊死2 日目のグループのOVLTは、1 日目と対照グループの両方よりも有意に高く、MEとAPの結果は1 日目と対照群の間で差異はありませんでした。
SFO、OVLT、ME および AP 切片の組織病理学的検査では、2 日目の群でより顕著な細胞損失が示されました。
カスパーゼ 3 陽性細胞密度は、他の 2 つのグループよりも 2 日目のグループでより強かった。対照グループにはカスパーゼ 3 陽性細胞がほとんどなく、1 日目のグループは 2 日目のグループよりもカスパーゼ 3 陽性細胞の数が少なかった。
考察
アポトーシスは細胞死の進化におけるメカニズムの 1 つであり、臨床的および実験的な SAH
の後に見られる可能性があります。CVO のこの研究では
strong>ラットで実験的なSAHを行った後、SFO、OVLT、AP、およびMEでアポトーシスが見られました。 1 日目の研究グループでは、SFOを除くすべてのCVOでホスファチジルセリン（早期アポトーシス） に対するアネキシン V の親和性が増加していることがわかりました。イン・ザ・デイ 2g読み取り: 0
